The Receptor Tyrosine Kinase Alk Controls Neurofibromin Functions in Drosophila Growth and Learning

Anaplastic Lymphoma Kinase (Alk) is a Receptor Tyrosine Kinase (RTK) activated in several cancers, but with largely unknown physiological functions. We report two unexpected roles for the Drosophila ortholog dAlk, in body size determination and associative learning. Remarkably, reducing neuronal dAlk activity increased body size and enhanced associative learning, suggesting that its activation is inhibitory in both processes. Consistently, dAlk activation reduced body size and caused learning deficits resembling phenotypes of null mutations in dNf1, the Ras GTPase Activating Protein-encoding conserved ortholog of the Neurofibromatosis type 1 (NF1) disease gene. We show that dAlk and dNf1 co-localize extensively and interact functionally in the nervous system. Importantly, genetic or pharmacological inhibition of dAlk rescued the reduced body size, adult learning deficits, and Extracellular-Regulated-Kinase (ERK) overactivation dNf1 mutant phenotypes. These results identify dAlk as an upstream activator of dNf1-regulated Ras signaling responsible for several dNf1 defects, and they implicate human Alk as a potential therapeutic target in NF1

The role of the RAS/RAF/MAPK signaling pathway in learning and memory processes in drosophila melanogaster

The RAS, RAF and mitogen-activated protein kinase / MAPK proteins, regulate key cellular functions such as cell growth and proliferation as well as learning and memory. Recently discovered germline mutations in genes that encode members of this signaling pathway are categorized into a group of human syndromes with similar phenotypes, referred to as neurocardio- facio-cutaneous - NCFC syndromes, with most prominent members the Neurofibromatosis type 1 and Noonan Syndromes. Patients of these syndromes exhibit high prevalence of mental retardation (MR) and behavioral disorders. However, the molecular events necessary to activate and regulate the RAS/MAPK kinase cascade in neurons remain poorly understood. In this study, using Drosophila melanogaster, we demonstrate that the adaptor protein DRK/GRB2 (Downstream of Receptor Kinase), essential for signaling to RAS, is essential in Mushroob Body (MB) neurons, the center of olfactory learning and memory in insects, to support adequate levels of learning, a process that requires activation of the RAF kinase. Drk heterozygous mutants show deficits in olfactory learning and memory, which become apparent under reduced training conditions. Moreover, activation of MAPK is impaired in drk mutant animals and paradoxically negatively regulated by constitutive activation of RAF kinase. Furthermore, we demonstrate that the 3 main Drosophila RAS proteins accumulate selectively in the MB neurons in a protein-dependent differential expression pattern, while affecting olfactory learning and memory in a unique way, depending on changes in their activity. Specifically, RAS1 and RAP inhibit olfactory learning, since increasing their activity reduced the learning performance index, while RAS2 does not seem to be involved in this process. Additionally, RAS1 and RAS2 appear to inhibit memory and reducing their activity, increased the performance index of the relevant animals tested for three-hour memory. Investigating the in vivo role of upstream activators of the RAS/ERK pathway, we present two new roles for the Drosophila ortholog of the receptor tyrosine kinase (RTK) Anaplastic lymphoma kinase dAlk, in the determination of body size and olfactory associative learning. Limiting the activity of dAlk increased body size and enhanced associative learning, supporting a inhibitory role for the RTK in these processes. Conversely, over-activation of dAlk resulted in reduction of body size and learning deficits, phenotypes also present in null Nf1 mutant flies lacking the Ras-GTPase Activating Protein Neurofibromin-1 (dNf1). We show that dAlk and dNf1 extensively colocalize and interact functionally in the nervous system. Genetic or pharmacological inhibition of dAlk rescued all examined dNf1 phenotypes including body size, learning deficits and over-activated Extracellular-Regulated-Kinase (ERK) levels. .................Οι πρωτεΐνες RAS, RAF και η κινάση ενεργοποιούμενη από μιτογόνα (mitogen-activated protein kinase/MAPK), ρυθμίζουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες όπως την κυτταρική αύξηση και πολλαπλασιασμό καθώς και διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Πρόσφατα, ανακαλύφθηκαν γαμετικές μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν μέλη του σηματοδοτικού μονοπατιού RAS/MAPK και κατηγοριοποιούνται σε μία ομάδα ανθρώπινων συνδρόμων με παρόμοιους φαινοτύπους, αναφερόμενα ως νευρο-καρδιο-προσωπο-δερματικά (neuro-cardio-facio-cutaneous – NCFC) σύνδρομα, με συχνότερα εμφανιζόμενα μέλη τις ασθένειες Νευροϊνωμάτωση τύπου 1 και σύνδρομο Noonan. Στους ασθενείς των συνδρόμων αυτών παρατηρείται μεταξύ άλλων, υψηλή επικράτηση διανοητικής καθυστέρησης (ΔΚ) και συμπεριφορικές διαταραχές. Παρ’όλα αυτά, τα αναγκαία μοριακά γεγονότα για την ενεργοποίηση του καταρράκτη κινασών RAS/MAPK και για την διατήρηση της ρύθμισής του δεν έχουν διερευνηθεί διεξοδικά. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας την Drosophila melanogaster ως μοντέλο, παρουσιάζουμε ότι η πρωτεΐνη προσαρμοστής DRK/GRB2 (Downstream of Receptor Kinase), απαραίτητη για τη σηματοδότηση στην πρωτεϊνη RAS, χρειάζεται στους νευρώνες των μανιταροειδών σωματίων (ΜΣ), το κέντρο της οσφρητικής μάθησης και μνήμης των εντόμων, για να υποστηρίξει ικανοποιητικά επίπεδα μάθησης, διεργασία η οποία απαιτεί την ενεργοποίηση της κινάσης RAF. Οι drk ετερόζυγες μεταλλαγμένες μύγες παρουσιάζουν ελλείμματα στην οσφρητική μάθηση και μνήμη, τα οποία γίνονται εμφανή υπό συνθήκες μειωμένης εκπαίδευσης. Η ενεργοποίηση της MAPK είναι ελλατωμματική στις drk μεταλλαγμένες μύγες και παραδόξως ρυθμίζεται αρνητικά από την συνεχόμενη ενεργότητα της κινάσης RAF. Επιπλέον, παρουσιάζουμε ότι οι 3 κύριες Δροσοφιλικές RAS πρωτεΐνες συσσωρεύονται επιλεκτικά στα ΜΣ η κάθε μία κατά διακριτό πρότυπο έκφρασης, ενώ τροποποιήσεις στην ενεργότητά τους επηρεάζουν την οσφρητική μάθηση και μνήμη κατά ξεχωριστό τρόπο, ανάλογα με την πρωτεΐνη. Συγκεκριμένα, oι RAS1 και RAP δρουν ανασταλτικά στην δημιουργία της οσφρητικής μάθησης, καθώς η αύξηση της ενεργότητάς τους μείωσε τον δείκτη μάθησης, ενώ η RΑS2 δεν φαίνεται να συμμετέχει στην δημιουργία μάθησης. Επιπλέον, οι RAS1 και RAS2 φαίνεται να δρουν ανασταλτικά στην δημιουργία μνήμης, καθώς η μείωση της ενεργότητάς τους, αύξησε τον δείκτη επίδοσης στην μνήμη τριών ωρών. Εξετάζοντας τον in vivo ρόλο άνωθεν ενεργοποιητών του μονοπατιού RAS/ERK, στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε δύο νέους ρόλους για το Δροσοφιλικό ορθόλογο γονίδιο του υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (Receptor Tyrosine Kinase – RTK) της κινάσης του αναπλαστικού λεμφώματος (Anaplastic Lymphoma Kinase – Alk) dAlk: στον καθορσιμό του σωματικού μεγέθους και στην οσφρητική συνειρμική μάθηση. Ο περιορισμός της ενεργότητας της dAlk αύξησε το σωματικό μέγεθος και ενίσχυσε την συνειρμική μάθηση, υποστηρίζοντας έναν ανασταλτικό ρόλο για τον υποδοχέα σε αυτές τις διεργασίες. .................